Book/Report

FZJ-2019-01702

http://join2-wiki.gsi.de/foswiki/pub/Main/Artwork/join2_logo100x88.png Untersuchungen zur Regulation der Expression des Gens für das SecA-Protein, einer zentralen Komponente des Proteinexportapparates von $\textit{Bacillus subtilis}$

Herbort, M. (Corresponding author)FZJ*

1996
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag Jülich

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/21758

Report No.: Juel-3310

Abstract: Bacillus Stämme sind von großer Bedeutung rur die biotechnologische Produktion von extrazellulären Enzymen, wie Z.B. Proteasen und Amylasen. Die Sekretion dieser Enzyme ist in $\textit{Bacillus subtilis}$ im Übergang vom exponentiellen Wachstum in die stationäre Phase maximal und die Regulation der Expression der Gene sekretorischer Proteine ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Dagegen wurden bisher keine Untersuchungen zur Genexpression der Komponenten des Proteinexportapparates von Gram-positiven Bakterien durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Expression des $\textit{secA}$-Gens, das für eine Untereinheit der Translokase von $\textit{B. subtilis}$ kodiert, untersucht. Ziel der Arbeit war die Klärung der genomischen Organisation des $\textit{secA}$-Gens und der benachbarten Gene. Dies beinhaltete die Identifizierung von Promotoren und Transkripten, die Untersuchung der $\textit{secA}$-Expression in Abhängigkeit von der Wachstumsphase, sowie Untersuchungen zur Beeinflussung der $\textit{secA}$-Genexpression durch unterschiedliche Kultivierungsbedingungen oder Veränderung des genetischen Hintergrundes. Im Verlauf der Arbeiten konnte mit Northern BIot Hybridisierungen gezeigt werden, daß das $\textit{secA}$-Gen von $\textit{B. subtilis}$ das erste Gen eines bicistronischen Operons ist, welches aus den Genen rur SecA und RF-2 ($\textit{prfB}$) besteht. Das RF-2 Protein ist für die Freisetzung von Ribosomen von den mRNAs nach Beendigung der Proteinsynthese verantwortlich. Ferner wurde für den stromaufwärts von $\textit{secA}$ gelegenen Leserahmen $\textit{orf189}$ eine monocistronische Organisation nachgewiesen. Primer Extension Experimente führten zur Identifizierung von $\sigma^{A}$-, $\sigma^{B}$- bzw. $\sigma^{H}$-abhängigen Promotoren direkt vor $\textit{orf189}$. Die Transkription von $\textit{orf189}$ steht, wie Integrationsmutanten im $\textit{secA}$-Locus von $\textit{B. subtilis}$ zeigten, in keinem physiologischen Zusammenhang mit der $\textit{secA}$-Transkription. Der Promotor des $\textit{secA}$-Gens konnte durch Primer Extension Experimente identifiziert werden und zeigt hohe Homologie zu vegetativen ($\sigma^{A}$) Promotoren von $\textit{B. subtilis}$. Die größte Aktivität des Promotors wurde mit Hilfe von Northern Blot und Reportergen-Versuchen im exponentiellen Wachstum gemessen. Der Verlauf der $\textit{secA}$-Expression zeigte deutlich ein Maximum der Genexpression am Ende der exponentiellen Phase, an dem auch die verstärkte Sekretion von Exoenzymen nachgewiesen wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde die größte Menge an $\textit{secA}$-mRNA, SecA-Protein und Reportergen-Aktivität nachgewiesen. Die $\textit{secA}$-Expression scheint demnach auf den Beginn der größten Sekretionsaktivität optimiert zu sein. Danach zeigte sich, daß die Transkription von $\textit{secA}$ im Verlauf der stationären Phase auf ein Minimum gesenkt wurde und die SecA-Konzentration der Zelle daraufhin während der stationären Phase deutlich abnahm. Das bis dahin synthetisierte SecA-Protein reicht aufgrund seiner hohen Stabilität offensichtlich für alle weiteren Vorgänge in der stationären Phase sowie bei der Sporulation aus. Es wurde keine Zunahme der $\textit{secA}$-Expression in der stationären Phase beobachtet. Die Untersuchungen zur $\textit{secA}$-Expression zeigten weiterhin, daß die Expression des $\textit{secA}$-Gens anders als die Gene vieler Exoenzyme unabhängig von der Katabolit-Repression und dem Regulatorpaar DegU/DegS erfolgt, so daß die Expression des $\textit{secA}$-Gens offensichtlich nicht der gleichen Regulation unterliegt, wie die Expression sekretorischer Proteine. Ferner zeigte sich die $\textit{secA}$-Expression unbeeinflußt von der Überexpression eines sekretorischen Proteins. Die detaillierte Untersuchung der $\textit{secA}$-Expression in der exponentiellen Wachstumsphase in verschiedenen Ansätzen und die Verwendung von konditionierten Medien zeigten dagegen deutlich, daß die Expression von $\textit{secA}$ über einen oder mehrere extrazelluläre Faktoren reguliert ist ("quorum sensing"). Diese Faktoren scheinen sich im Verlauf des exponentiellen Wachstums im Medium anzureichern und bewirken so eine stetige Zunahme der $\textit{secA}$-Expressionbis zum Erreichen des Endes der exponentiellen Wachstumsphase. Weiterhin wurden Hinweise für eine Autoregulation der $\textit{secA}$-Expression gefunden.

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Contributing Institute(s):

1. Publikationen vor 2000 (PRE-2000)

Research Program(s):

1. 899 - ohne Topic (POF3-899) (POF3-899)

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Database coverage:

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